Als vijfde kind uit een arm gezin werd Leoš Janáček geboren op 3 juli 1854 in Hukvaldy, een Tsjechisch dorpje nabij de grens met Polen. Zowel zijn vader als zijn grootvader waren musicus en onderwijzer. Op zijn elfde stuurden zijn ouders naar Brno, de hoofdstad van Moravië, gestuurd om er te zingen in het jongenskoor van een augustijnerklooster. 

Leoš zou net zoals zijn vader in het onderwijs gaan. En dat gebeurde ook: hij kreeg in 1869 een studiebeurs om een lerarenopleiding te volgen, en gaf daarna gedurende twee jaar les op een school. Maar de muziek boeide hem meer. In 1873 richtte hij zijn eigen koor op en een jaar later ging hij naar Praag om er orgelles te volgen. Zijn eerste composities dateren van deze periode.

In 1875 keerde hij terug naar het klooster, waar hij koorleider werd. Hij schreef voor het koor een 'Exaudi Deus' met orgelbegeleiding. Hij leidde het koor van Olomouc en dirigeerde het filharmonisch orkest van Brno, waarmee hij het Requiem van Mozart en de Missa Solemnis van Beethoven opvoerde.

Twee jaar later, in 1877 ging hij opnieuw naar Praag, waar hij Dvořák leerde kennen. Kort daarna ging hij zes maanden aan het conservatorium van Leipzig studeren, en daarna nog eens een half jaar aan het conservatorium van Wenen.

In 1881 trouwde hij met de dochter van de directeur van de lerarenopleiding. Hij was toen 26, zij nog maar 15. Het huwelijk heeft maar een aantal jaren stand gehouden, maar Janácek kreeg steeds meer zelfvertrouwen. Hij wilde van Brno een groots muziekcentrum maken. Hij werd zeer actief: hij onderwees, bestudeerde de volksmuziek, dirigeerde en richtte een krant op. Er werd zelfs een nieuw theater geopend in de stad, en Janácek richtte er zijn eigen orgelschool, waarvan hij directeur bleef tot in 1903.

Van dan af begint een minder rooskleurige periode in Leoš' leven. In 1882 begint hij aan zijn opera 'Sárka', maar de libbretist, die liever met Dvořák had samengewerkt, verbood hem tenslotte zijn tekst te gebruiken. Hij leefde ook gescheiden van zijn vrouw omdat hij zijn moeder had gevraag bij hem te komen wonen. Een paar jaar later werd er een zoontje doodgeboren.

Janáčeks ontwikkeling als componist begon uitzonderlijk laattijdig. Pas de eeuwwisseling was zijn muzikale persoonlijkheid echt ontwikkeld. Tussen 1894 en 1903 had hij hard gewerkt aan zijn opera 'Jenufa' en aan de cantate 'Amarus'. Uiteindelijk ging 'Jenufa' in Brno in première, en het werd een overweldigend succes, zij het op kleine schaal want de opera werd elders niet opgevoerd. Prompt daarna nam hij zijn ontslag als leraar en begon meer tijd te besteden aan zijn composities. In de jaren die volgden schreef hij een aantal opera's die nooit werden opgevoerd.

Pas in 1916, twaalf jaar na de première, werd 'Jenufa' in Praag opgevoerd, waar Janáček als genie beschouwd werd. Voor het eerst in zijn leven kon de 62-jarige componist van een groot succes spreken. Hij schreef nog vier opera's, een liederencyclus, een strijkkwartet, een blaassextet, de 'Glagolitisch Mis' en de 'Sinfonietta voor orkest'. In 1928 schreef hij nog een strijkkwartet, waarna hij stierf, op 12 augustus.